|
В 50-е годы прошлого века две группы ученых, возглавляемые одна Джоном Кендрю, другая Максом Перуцом, выяснили структуру гемоглобина и миоглобина, облучая их рентгеновскими лучами и используя затем метод рентгеноструктурного анализа (см. также X-ray crystallography). С этого момента рентгеновские лучи стали основным «помощником» в исследовании трехмерных структур макромолекул.
Однако биологические объекты, такие как клетки, органеллы (грубо говоря, «органы» клетки), вирусы и другие макромолекулы, трудно поддаются рентгеноструктурному анализу из-за невозможности их кристаллизации. Слабым местом рентгеноструктурного анализа является также требование высокого качества исследуемых кристаллов, например их периодичности. Чтобы как-то обойти эти проблемы, при рентгеноструктурном анализе частично упорядоченных или неупорядоченных вовсе объектов (белков, ДНК, вирусов и т. д.) физики прибегают к так называемому методу малоуглового рассеяния. Рентгеновское излучение в этом случае концентрируется вблизи первичного пучка — в области малых углов рассеяния, то есть является слабо расходящимся.
В работе Quantitative Imaging of Single, Unstained Viruses with Coherent X-rays, появившейся недавно в архиве препринтов, совместная группа ученых из США и Японии сообщила о том, что ею впервые получено рентгеновское изображение единичного вируса. Для этого был использован так называемый рентгеновский дифракционный микроскоп. Говоря об «изображении», авторы статьи имеют в виду визуализацию распределения электронной плотности внутри вируса — своего рода «фотографию», но только не в оптическом диапазоне, а в рентгеновском.
Ученым удалось получить высококонтрастное изображение вируса с почти рекордным разрешением — 22 нанометра (на сегодня рекордом разрешающей способности рентгеновского дифракционного микроскопа лучей является величина 15 нм, достигнутая в начале этого года; см. работу Nanoscale Imaging of Buried Structures with Elemental Specificity Using Resonant X-Ray Diffraction Microscopy в журнале Phys. Rev. Lett.). Обращает на себя внимание также тот факт, что исследованию подвергся объект с молекулярной массой на три порядка меньше, чем макромолекулы, исследованные ранее. «Сфотографирован» был мышиный вирус герпеса (MHV-68), деактивированный импульсом ультрафиолетового излучения и трехпроцентным раствором глутаральдегида (это вещество, которое часто используется для стерилизации медицинского оборудования и дезинфекции). Вирусы герпеса были растворены в метаноле с концентрацией около 20 штук на микролитр. Этот раствор и был исследован под рентгеновским дифракционным микроскопом.
Схема эксперимента приведена на рис. 1. Рентгеновское излучение с энергией 5 кэВ проходило через отверстие размером 20 микрометров, расположенное на расстоянии около 1 метра перед исследуемым объектом. Чуть впереди образца с вирусами располагалась кремниевая защитная прорезь для блокирования «паразитного» оптического излучения, идущего от камеры (о ней будет сказано далее). Полученное изображение фиксировалось расположенной в метре от объекта исследования камерой с ПЗС-матрицей (CCD-камера) с разрешением 1340 ? 1300 пикселей (размер одного пикселя составляет 20 микрометров).
Для изучения влияния рентгеновского излучения на вирус, то есть выяснения того, как сильно рентген изменяет его внутреннюю структуру, предварительно было сделано три снимка, один из которых приведен на рис. 2a. Аккуратное сравнение снимков показало, что поглощенная вирусом доза облучения (3·107 Грэй) существенно не изменяет «внутренности» вируса. На полученном изображении также можно увидеть, что размер вируса составляет приблизительно 200 нм.
Снимок, полученный камерой с ПЗС-матрицей, не является главным результатом исследователей. Важно понимать, что основные задачи рентгеноструктурного анализа (в частности, в этом эксперименте) — это прежде всего установление размеров и формы элементарной ячейки кристаллической структуры вещества и последующее определение принадлежности кристалла к одной из групп симметрии, коих всего насчитывается 230. Для этого необходимо математически обработать значения интенсивностей всех дифракционных отражений от данного объекта. Окончательная цель такой обработки состоит в вычислении по экспериментальным данным значений электронной плотности ? (х, y, z) в любой точке ячейки кристалла с координатами х, y, z. Так как строение кристалла приблизительно периодическое, то существует возможность записать электронную плотность в нём через ряд Фурье:
Здесь V — объем элементарной ячейки, h, k, l — некоторые целые числа, называемые индексами Миллера (грубо говоря, они обозначают, как располагаются атомные плоскости в кристалле), i — мнимая единица и, наконец, самое важное — Fhkl, коэффициенты ряда Фурье, называемые структурными амплитудами. Эти математические «сложности» необходимы для того, чтобы «просуммировать» дифракционные рентгеновские отражения и затем получить изображение микроструктуры кристалла, поскольку не существует линз, способных фокусировать рентгеновское излучение.
|
Рис. 2. Изображение вируса, полученное с помощью камеры с ПЗС-матрицей (a); рентгеновское изображение вируса (b); снимок вируса под сканирующим и просвечивающим электронным микроскопом (c и d соответственно). Рис. из обсуждаемой статьи arXiv:0806.2875Fhkl = |Fhkl|exp(i?hkl)
В эксперименте по дифракции рентгеновских лучей физически измерить можно лишь модуль |Fhkl|, а точнее, его квадрат |Fhkl|2, но не фазу. И это главная проблема в рентгеноструктурном анализе. Существуют разные модели структурной «расшифровки» экспериментальных данных. Например, метод проб и ошибок. В этом методе выбирается некая пробная физическая модель, в которой считаются значения |Fhkl|mod и сравниваются с экспериментальными данными |Fhkl|exp. В зависимости от значения так называемого R-фактора (фактора расходимости):
предложенную модель либо принимают, либо отвергают. Разумеется, оптимальный выбор модели происходит, когда значение R-фактора равно нулю.
Для более сложных структур, в том числе и некристаллических, как в описываемой работе, например, применяется такой метод «расшифровки» данных: структурные амплитуды и их фазы рассматриваются как случайные величины. Далее выводятся функции распределения этих случайных величин, которые дают возможность оценить, с учетом экспериментальных данных, наиболее вероятные значения фаз. А далее, используя формулу (1), получают искомое распределение электронной плотности, а вместе с ним и изображение изучаемого объекта. Здесь мы кратко описали далеко не все методы «расшифровки» данных, но критерием пригодности этих методов в каждом случае является R-фактор.
В этой работе для «расшифровки» данных авторы пользовались методом под названием GHIO (guided hybrid input-output algorithm), несколько похожим на метод случайных величин. Этим методом авторы расшифровали 16 дифракционных изображений и среди них выбрали пять с наименьшим значением R-фактора. Затем эти пять изображений были «усреднены» и таким образом было получено окончательное изображение (рис. 3a). Поскольку метод, использованный в данном эксперименте, основывался на случайных величинах, то авторы применили его еще раз для этих 16 изображений, повторив процедуру выборки пяти лучших изображений и затем их дальнейшего усреднения (рис. 3b). По утверждению авторов, различие этих рисунков, не превышает 2,3%, что говорит о корректности этого метода «расшифровки».
|
Также исследователями было получено изображение вируса с помощью сканирующего (Scanning electron microscope, рис. 2c) и просвечивающего (Transmission electron microscopy, рис. 2d) электронных микроскопов. Сравнивая данные изображения, можно, по утверждению авторов, увидеть, что рентгеновский снимок вируса (рис. 2b) обладает наибольшей контрастностью. Для лучшей визуализации полученного рентгеновского изображения исследователи раскрасили снимок в соответствии со значениями электронной плотности внутри вируса (рис. 4а). Изображение 4b с помощью атомно-силового микроскопа (см. также Atomic force microscope) приведено для уточнения толщины вируса.
|
Рис. 5 показывает распределение электронной плотности вдоль пунктирной линии, изображенной на рис. 4a.
|
В заключении исследователи говорят о том, что достигнутое ими разрешение 22 нм в получении рентгеновского изображения вируса не является пределом и, скорее всего, может быть улучшено с помощью проекта X-FEL — источника когерентного рентгеновского излучения (рентгеновского лазера) на свободных электронах, что позволит в дальнейшем заняться получением более детальных снимков макромолекул, в частности белковых комплексов.
