|
Транспортом веществ в ядро занимается белок импортин (см. Importin). Его субстраты помечены специальной последовательностью, которая называется nuclear localization signal, или NLS. Соединившись с субстратом, импортин «садится» на ядерную пору и пролезает сквозь канал на внутриядерную сторону мембраны. Там с ним связывается маленький белок ГТФаза Ran в комплексе с ГТФ; из-за этого комплекс импортин–субстрат разваливается и субстрат оказывается в ядре. А импортин вместе с Ran-ГТФ идет назад в цитоплазму. Там Ran гидролизует ГТФ до ГДФ под действием специального активирующего белка, отделяется от импортина, подхватывается белком-переносчиком под названием NTF2 и через ядерную пору отправляется назад в ядро. Ядерный белок RanGEF заменяет ГДФ на ГТФ, и после этого Ran снова может связываться с импортином.
Квантовые точки, которые использовались в обсуждаемых экспериментах, были достаточно ярки, чтобы наблюдать за ними с нанометровой точностью в миллисекундном разрешении — и это отличало их от обычных флуорофоров и давало ученым возможность изучить ядерный транспорт с невиданной прежде тщательностью. Каждая точка несла на себе сайты связывания для одной из субъединиц импортина — импортина ?; после того как к ней присоединялось около 40 молекул этого белка, ее диаметр составлял 30 ± 6 нм. Получалось, что данные квантовые точки больше, чем одиночные белковые молекулы, идущие из цитоплазмы в ядро, но сравнимы по размеру с другими субстратами, например с некоторыми вирусными капсидами, которые могут целиком, не разбираясь на кусочки, проходить сквозь ядерную пору.
Исследования проводились in vitro, в них участвовали 849 квантовых точек. Все они смогли проникнуть в ядерную пору, но попасть в ядро удалось только 177. Ученые выбрали 56 траекторий (и «удачных», и «неудачных») с самым лучшим разрешением и исследовали их подробнее.
Выяснилось, что некоторые точки перед тем, как попасть в пору, «топчутся» возле нее довольно долгое время. Исследователи предположили, что они связываются с цитоплазматическими филаментами (см. Protein filament), которые окружают пору и направляют груз в нужную сторону. Таким образом, отметив участки наиболее частого «зависания» точек, можно определить местоположение этих филаментов.
Оказавшись внутри канала поры, грузы могли либо пройти его насквозь и проникнуть в ядро («счастливчики»), либо провести там некоторое время, а потом всё же вернуться назад в цитоплазму. Этих последних «неудачников» ученые разделили на две группы — некоторые проходили внутри канала совсем маленькое расстояние (меньше 30 нм) и сразу «выплевывались» назад в цитоплазму («ранние неудачники»), а другим удавалось проникнуть довольно глубоко (до 60 нм) по каналу по направлению к ядру («поздние неудачники»). Изучив траектории движения точек внутри канала поры, исследователи смогли уточнить размеры этого канала — судя по всему, он составляет 55 нм в ширину и 68 нм в длину.
|
Надо сказать, что некоторые «счастливчики» и «поздние неудачники» часто вначале вели себя как «ранние неудачники» и несколько раз «выплевывались» назад в цитоплазму, не пройдя и половины канала. Исследователи предположили, что в начале поры есть сужение, которое некоторые грузы, имеющие размер на границе дозволенного, не могут одолеть сразу. Чтобы проверить эту гипотезу, ученые запустили в канал квантовые точки большего диаметра. Эти грузы гораздо чаще становились «ранними неудачниками», что подтверждало наличие в начале канала сужения (судя по всему, где-то до 40 нм).
Один из главных вопросов, стоящих перед исследователями, изучающими транспорт веществ через пору, — двигается ли груз внутри канала целенаправленно или «мечется» по законам диффузии? Рассмотрев передвижения квантовых точек внутри канала, ученые отмели предположения о направленном движении груза и заключили, что он передвигается по законам аномальной субдиффузии (если упрощать, то это почти диффузия, просто проходящая неравномерно в разных направлениях и более вялая, чем обычная). При этом вдоль канала частицы движутся гораздо свободнее, чем поперек.
Перед исследователями стоял еще один важный вопрос — как влияет количество присоединенных импортинов на передвижение груза? Будет ли груз, на который «налипло» больше импортиновых молекул, проходить сквозь пору легче благодаря лучшему сродству к поверхности поры — или, наоборот, тяжелей, потому что импортины будут постоянно связываться с белками поры и тормозить его? Чтобы выяснить это, ученые создали квантовые точки с примерно вдвое меньшим количеством сайтов связывания для импортина ?. Оказалось, что такие точки «зависают» в канале поры гораздо дольше, чем контрольные. Иными словами, чем с меньшим количеством молекул импортина связался груз, тем тяжелее ему будет пройти через пору, и наоборот.
И последний вопрос: в какой момент в игру включается Ran? Как этот белок влияет на передвижения груза внутри канала и влияет ли вообще? Чтобы найти ответ на этот вопрос, исследователи записали траектории передвижения квантовых точек в отсутствие Ran. Оказалось, что его отсутствие никаким образом не влияет на перемещения груза в поре и уж тем более в цитоплазме. Единственное отличие, которое обнаружили ученые, — это что без Ran грузы не в состоянии совершить последний шаг и попасть из канала поры внутрь ядра. Это не только проясняет роль Ran, но и показывает, что канал поры функционально ассиметричен — в отсутствие Ran он с гораздо большей вероятностью «выплюнет» груз назад в цитоплазму, чем позволит ему оказаться в ядре. Но вот как так получается, что груз может без проблем вернуться в цитоплазму, а в ядро пролезть не может — пока что совершенно неясно. Непонятен до конца и механизм работы Ran. Будем надеяться, что дальнейшие исследования смогут разгадать эти загадки.
|
Резюмируя полученные данные, исследователи предложили разделить ядерный транспорт на несколько стадий:
1) Филаменты захватывают груз в цитоплазме и направляют его к каналу поры. Эта стадия необязательная, ее наличие или продолжительность не влияют на дальнейшую судьбу груза — просто филаменты позволяют расширить область, из которой плавающий по цитоплазме груз может попасть в ядро.
2) Груз проходит через сужение в начале канала. Если размеры груза слишком велики, то на этой стадии путешествие в ядро для него заканчивается.
3) Грузы аномально субдиффундируют внутри канала, причем чем больше импортинов «облепляет» груз, тем легче ему передвигаться.
4) И наконец, последний шаг — с помощью Ran груз попадает в полость ядра.
Первые три этапа обратимы, а последний — необратим. Если уж груз попал в ядро, то там он и останется. Разве что он каким-то образом окажется помечен сигналом ядерного экспорта (см. Nuclear export signal). Но это — совсем другая история.
