Согласно теории РНК-мира, на заре жизни должны были существовать рибозимы (молекулы РНК с каталитическими свойствами), способные осуществлять матричный синтез (размножение) молекул РНК. В природе такие рибозимы не обнаружены, а созданные искусственно работают очень плохо. Сочетая методы «эволюции в пробирке» и «разумного дизайна», американские ученые изготовили улучшенный рибозим с РНК-полимеразной активностью, способный копировать молекулы РНК длиной до 95 нуклеотидов (прежний рекорд – 20). При помощи нового рибозима впервые удалось осуществить размножение функциональной молекулы РНК (другого рибозима) без участия белков-ферментов.
Ключевым компонентом РНК-мира предположительно были молекулы РНК с РНК-полимеразной активностью, то есть рибозимы, катализирующие репликацию (размножение) молекул РНК. Без таких рибозимов в мире РНК была бы невозможна настоящая наследственность и дарвиновская эволюция. У современных живых организмов такие рибозимы не обнаружены: по-видимому, они давно вытеснены более эффективными белковыми ферментами-полимеразами. Поэтому для того, чтобы реконструировать ранние этапы зарождения жизни, а заодно и окончательно доказать возможность существования устойчивого и способного к дарвиновской эволюции мира РНК, очень важно получить такой рибозим искусственно.
Ученые бьются над этой задачей уже более 10 лет, применяя попеременно то метод искусственной эволюции (случайные мутации + отбор удачных вариантов), то сознательное проектирование. Оба метода сталкиваются с серьезными трудностями. Возможности «разумного дизайна» ограничены отсутствием надежных методов предсказания каталитических свойств рибозимов по их первичной структуре (последовательности нуклеотидов). Для эффективной «искусственной эволюции» нужно научиться каким-то образом выбирать из огромного множества слегка различающихся молекул ту, которая лучше всех справляется со своей задачей, в данном случае — с копированием молекул РНК (см.: Эволюция под управлением компьютера, «Элементы», 12.04.2008). Это непросто, потому что те рибозимы-полимеразы, которые удалось получить на сегодняшний день, не могут размножать сами себя (в этом случае проблема отбора была бы решена: какого рибозима в пробирке окажется больше, тот и «победитель»). Речь пока идет только о копировании фрагментов других молекул РНК (матриц), причем не любых, а со строго определенной нуклеотидной последовательностью. Если просто поместить в пробирку миллион разных рибозимов, то как потом узнать, какой из них насинтезировал больше копий матрицы?
Правда, уже известны рибозимы, способные катализировать свой собственный синтез, но не из отдельных нуклеотидов, а из целых больших кусков РНК — олигонуклеотидов. Такие рибозимы действительно могут сами себя размножать, но в качестве «пищи» (исходного субстрата) им необходимы, по сути дела, их собственные крупные фрагменты (см.: Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009).
Что касается настоящих рибозимов-полимераз, которые синтезируют на матрице РНК комплементарную молекулу из отдельных нуклеотидов, то до сих пор лучшее, что удалось создать ученым, — это рибозим R18.
Этот рибозим использует в качестве матрицы одноцепочечную молекулу РНК с заранее подготовленной «затравкой» (праймером). Праймер — это небольшой кусочек комплементарной цепи РНК, присоединенный к одному из концов матрицы (рис. 1). Рибозим R18 достраивает комплементарную цепь, начиная от праймера. Максимум, чего от него можно добиться, — это присоединения 15–20 комплементарных нуклеотидов. Иными словами, если повезет, он может скопировать фрагмент молекулы РНК (матрицы) длиной до 20 нуклеотидов. В большинстве случаев, впрочем, процесс репликации РНК прерывается раньше. У R18 есть еще один недостаток: он копирует далеко не любую матрицу, а только весьма узкий круг нуклеотидных последовательностей. Эффективность работы R18 сильно зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Этим R18 радикально отличается от «настоящих», белковых полимераз, которые копируют любые матрицы с одинаковой эффективностью и которым совершенно всё равно, в какой последовательности расположены в матрице нуклеотиды.
Попытки радикально улучшить работу R18 до сих пор были безуспешны. Появились даже опасения, что R18 представляет собой «эволюционный тупик», что его в принципе нельзя усовершенствовать путем внесения небольших изменений и нужно искать что-то совсем другое. Надо сказать, что пространство для поиска невообразимо велико: рибозим R18 состоит из 189 нуклеотидов; общее число возможных молекул РНК такой длины равно 4189 ? 10114. Это на много порядков больше числа элементарных частиц во Вселенной. Перепробовать все эти варианты, разумеется, невозможно.
Новая работа американских молекулярных биологов, опубликованная в журнале Science, показала, что R18 всё-таки не является тупиком, и на его основе можно изготовить более эффективные РНК-полимеразы. Выяснить это позволила новая методика, благодаря которой удалось резко ускорить «искусственную эволюцию» рибозимов с полимеразной активностью. Суть методики в том, что ДНК-овые гены множества слегка различающихся рибозимов прикрепляют к крошечным магнитным шарикам, которые, в свою очередь, помещаются в водно-жировую эмульсию, так что каждый шарик со своим геном оказывается изолирован от остальных в маленькой водяной капле. В этой капле при помощи ферментов осуществляется транскрипция — синтезируется множество копий рибозима, после чего рибозимам дают возможность реплицировать РНК-матрицу. Затем следует еще несколько хитрых операций, в результате которых те шарики, на которых рибозимы поработали наиболее успешно, метятся флуоресцентными метками. Остается только извлечь ярко светящиеся шарики и выяснить (путем секвенирования прикрепленного к шарику гена), что за рибозим так хорошо справился со своей работой.
Эта замечательная методика (в сочетании с еще несколькими методологическими новшествами) позволила авторам перепробовать десятки миллионов модификаций исходного рибозима R18. Конечно, десятки миллионов — это исчезающе малая доля от устрашающего числа 10114. Тем не менее этого оказалось достаточно, чтобы найти варианты, справляющиеся с функцией РНК-полимеразы намного лучше, чем R18.
Отбор велся в двух направлениях. С одной стороны, отбирались рибозимы, способные наиболее эффективно копировать одну стандартную матрицу. Так был получен рибозим C19 (фигура B на рис. 2). Разобравшись в его структуре, авторы сумели внести в него дополнительные усовершенствования методом «разумного дизайна» и получили еще более эффективный рибозим tC19 (фигура C). После этого был проведен еще и отбор матриц: внося изменения в стандартную матрицу, авторы «вывели» такую ее модификацию, которую рибозим tC19 копирует наиболее эффективно. В результате удалось поставить рекорд: рибозим скопировал участок молекулы РНК длиной в 95 нуклеотидов. На сегодняшний день это самая длинная молекула РНК, синтезированная рибозимом из отдельных нуклеотидов.
В другой серии экспериментов авторам удалось, используя несколько разных матриц, вывести рибозим, полимеразная активность которого не так сильно зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Этот рибозим обозначили буквой Z (фигура D на рис. 2).
После этого ученые объединили полезные новшества, характерные для рибозимов tC19 и Z, в одной молекуле, и создали свой шедевр — рибозим tC19Z (фигура Е на рис. 2). В этом рибозиме соединились высокая полимеразная активность рибозима tC19 с повышенной универсальностью (низкой зависимостью от матрицы) рибозима Z.
Рибозим tC19Z способен копировать довольно широкий круг матриц, причем делает он это с меньшим числом ошибок, чем все выведенные ранее рибозимы-полимеразы. Исходный рибозим R18 делает в среднем 4,3 ошибок на 100 присоединенных нуклеотидов, tC19 работает точнее (2,7 неправильных или пропущенных нуклеотидов на сотню), tC19Z ошибается еще реже (0,88 ошибок на 100 нуклеотидов).
Чтобы наглядно продемонстрировать широкие возможности рибозима tC19Z, авторы успешно размножили с его помощью не специально созданную для этой цели и больше ни на что не годную матрицу, а настоящую функциональную молекулу РНК — другой рибозим, известный под названием Mini-hammerhead. Этот крошечный рибозим состоит всего из 24 нуклеотидов, но он обладает собственной каталитической функцией (эндонуклеазной активностью): он умеет разрезать РНК с определенной нуклеотидной последовательностью в одном строго определенном месте. Рибозим tC19Z успешно справился с копированием рибозима Mini-hammerhead. Тем самым впервые была продемонстрирована репликация функциональной молекулы РНК при помощи рибозима-полимеразы.
Полученные авторами результаты — важный шаг на пути к созданию (или воссозданию?) полноценных рибозимов — РНК-полимераз, появление которых когда-то придало РНК-миру способность к дарвиновской эволюции. Можно надеяться, что разработанные авторами новаторские методы ускорят прогресс в понимании ранних этапов становления земной жизни.
Интересно: Авторынок Архангельск осуществляет продажу автомобилей в Архангельске.
