В конце XIX века величавый Филипп Жолли уговаривал юного Макса Планка не заниматься теоретической физикой. Она представлялась тогда в главном законченным и поэтому совсем бесперспективным делом. Планк не послушался наставника и стал одним из создателей квантовой теории. За несколько десятилетий необыкновенных открытий от обычный и стройной физической картины мира конца XIX века не осталось и следа. Век спустя схожая картина сложилась в молекулярной генетике. К началу 1990-х годов ее здание казалось в главном достроенным, оставалось только разъяснить несколько малозначительных фактов... Но сейчас уже ясно, что эти представления были чуть ли не настолько же наивны, как рассуждения о генетике в определениях Ветхого Завета.
«Наноробот цепляет инфицированную клеточку крови, ныряет вовнутрь нее и вставляет собственный молекулярный штырь в механизм, который штампует вирусы, останавливая ее работу». Утопическая история в стиле величавого прожектера нанотехнологий Эрика Дрекслера? Никакой фантастики. Это всего только облегченный пересказ научной работы, не так давно размещенной в одном из самых знатных научных журналов — Cell.
Команда ученых из США, Южной Кореи и Германии практически добралась до чаши Грааля — им удалось приостановить заразу вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Правда, пока только у мышей с пересаженной людской иммунной системой, да и это большущее достижение. Генетический аппарат, который при всем этом употребляется, 20 годов назад вообщем не был известен, 10 лет числился редчайшей особенностью растений и червяков, а на данный момент за ним признают колоссальную роль в развитии всех высших организмов и ожидают от него новых прорывов в медицине.
Когда гены казались ординарными
Картина работы генетического аппарата представлялась в те годы достаточно ясной. Генетическая информация хранится в ядре, закодированная в двойной спирали молекул ДНК. Она временно копируется на молекулы РНК, выносится ими из ядра клеточки и употребляется для синтеза белков. Эта схема уже издавна стала традиционной и вошла в школьные учебники. На ее базе расцвела генная инженерия — искусство целенаправленных манипуляций с генетической информацией в клеточке. Казалось необычным, что работа генетического кода устроена так остроумно и просто.
Генетический код в чем либо похож на компьютерную программку. Компьютерные аннотации записываются в цифровом виде на жестком диске компьютера, генетический код — тоже в цифровом виде на хим носителе: двухцепочечной молекуле ДНК. Исходя из убеждений традиционной генетики эта программка в постоянном виде передается из поколения в поколение. Ну либо практически в постоянном — время от времени случаются мутации. Процесс копирования программки во время деления клеточки именуется репликацией. В каждую дочернюю клеточку, которая появляется в итоге деления, попадает реплика, другими словами четкая копия каждого гена из материнской ДНК. На вид модель двойной спирали ДНК похожа на перекрученную застежку-молнию с 4-мя видами зубцов, которые стыкуются попарно. При репликации застежка-молния двойной спирали ДНК расползается, и на каждой из половинок достраивается другая лента.
Покинув ядро клеточки, РНК несет генетическую депешу к большому молекулярному комплексу — рибосоме. Тут происходит трансляция — перевод генетического кода в структуру белковых молекул. Рибосома, двигаясь повдоль цепочки РНК (голубая), считывает код и добавляет к возрастающей молекуле белка (желтоватая) надлежащие аминокислоты. Фото: SPL/EAST NEWS
Генетическая программка должна не только лишь копироваться, да и производиться. В процессе ее работы создаются белки — главные молекулярные машины и строй блоки живой клеточки. Процесс происходит в два шага. Сначала информация с ДНК транскрибируется — переписывается на другой, очень схожий носитель — молекулу РНК. От ДНК она отличается строением 1-го зубчика из 4, также основой, на которой эти зубчики посиживают — она у РНК наименее крепкая. Причина понятна — если ДНК нужна для длительного хранения инфы, то РНК — временный носитель, расходный материал, разовые дискеты либо флэшки. Такая молекула РНК, на которую записана копия гена, именуется информационной, либо матричной (мРНК). Эта длинноватая цепочка — одна половинка «застежки-молнии» — может содержать до сотки тыщ зубчиков.
Когда переписывание инфы завершено, мРНК выходит из клеточного ядра и встречается с рибосомой — появляется молекулярный сборочный поток по производству белка. Каждые три зубчика РНК кодируют один строительный блок белка — аминокислоту. Всего же в белках встречаются 20 видов таких строй блоков, и они выстраиваются в цепочку строго в порядке, запрограммированном в РНК. Этот процесс именуется трансляцией — в компьютерном мире этим термином обозначают перевод текста программки в исполняемый машинный код. Сходя с рибосомы, цепочка аминокислот сходу сворачивается и образует устойчивую трехмерную структуру. Конкретно в таком виде белки делают свои функции в клеточке. Рибосомы могут не один раз передавать матричную РНК, раз за разом производя новые молекулы белка. Но мРНК неустойчива и через несколько часов разрушается. Потому числилось, что синтез каждого белка зависит приемущественно от синтеза соответственной мРНК в ядре клеточки.
Естественно, схема эта очень облегчена. Любой из процессов — репликация, транскрипция и трансляция — мог включать дополнительные этапы. К примеру, выяснилось, что скопированная с ДНК молекула РНК по пути к рибосоме подвергается дополнительному редактированию — процессингу. При всем этом из РНК могут вырезаться значимые куски кода, при этом в неких случаях различные, а могут избирательно заменяться отдельные буковкы генетического кода. Но все это не меняло сущности представлений о прямой магистральной дороге от ДНК через РНК к белку.
1-ые зерна колебаний по этому поводу взошли в 1990 году в горшках с петуниями по различные стороны океана. Внезапно результаты получили спецы из Амстердамского свободного института и сразу из не имеющейся на данный момент американской компании DNA Plant Technology, которая в конце 1990-х попала под трибунал за махинации с трансгенным табаком.
Цвет неожиданности
Лепестки петунии могут иметь различный цвет зависимо от активности ферментов, синтезирующих розовый либо фиолетовый пигмент. Что будет с растениями, которым ввели дополнительные копии генов, кодирующие эти ферменты? Хоть какой молекулярный биолог 20 годов назад ответил бы: очевидно, цвет лепестков станет более насыщенным. Но неиндивидуальная работа по селекции отдала парадоксальные результаты: цветки у трансгенных растений, которые должны могли быть производить больше пигмента, отчасти либо стопроцентно теряли собственный цвет. Это приблизительно как досыпать сахара в чай и ощутить, что он от этого стал наименее сладким.
Скоро голландские генетики-цветоводы узнали, что в бледноватых трансгенных петуниях транскрипция с ДНК на мРНК шла как обычно. Вот только трансляции, другими словами синтеза белка с этих матричных РНК не происходило. Покинув клеточное ядро, они почему-либо разрушались, не дойдя до рибосом. Разумеется, что механизм разрушения запускался в ответ на возникновение чужеродного генетического материала. А так как этот материал был похож на собственный свой, то механизм, тогда еще неведомый в деталях, не разбирался и заодно уничтожал мРНК, транскрибированные с собственных генов.
На пути от ДНК к рибосоме записанный на молекуле РНК текст генетической аннотации подвергается редактированию: заменяются отдельные слова, вырезаются излишние абзацы — интроны. Происходит это так. Так как матричная РНК состоит из одной цепочки, а не из 2-ух, как ДНК, любой из составляющих ее кирпичиков-нуклеотидов стремится отыскать для себя пару. Если в самой молекуле РНК есть «зеркальные» участки, они могут склеиться, образовав петлю, которая скоро отрезается. В 2000 году было открыто, что в различных случаях могут вырезаться различные куски РНК. Фото: SPL/EAST NEWS
Несложно было додуматься, для чего растениям был нужен таковой механизм борьбы с чужим генетическим материалом. У их, в отличие от животных, нет иммунной системы с антителами, макрофагами и лимфоцитами. Потому внутриклеточная борьба с чужими генами стала одним из немногих доступных средств антивирусной защиты. На то, чтоб обосновать это, ушло пару лет. В 1997 году было показано, что растения, у каких в геноме обнаруживаются недлинные «отрывки» вирусных генов, более устойчивы к действию этих вирусов. Ставили также и оборотный опыт: в вирус подсаживали кусок растительного генетического кода, и в зараженном этим вирусом растении замедлялся синтез собственного белка.
Обрадовавшись, что в генетике, которая уже стала преобразовываться в прикладную науку, появилось что-то новое, микробиологи стали всюду находить подобные механизмы. И отыскали. В 1998 году америкосы Крейг Мелло и Эндрю Файр (Craig Mello, Andrew Fire) выпустили эпохальную статью про развитие круглого червяка С.elegans. Это крохотное создание длиной около мм с середины 1970-х годов исправно служит модельным организмом для исследовательских работ (оно даже может привыкать к никотину и мучиться от абстиненции). Мелло и Файра заинтересовывало, как оказывает влияние на развитие клеток сторонняя РНК. C.elegans был безупречной моделью для таких тестов — молекулы мРНК просто проникали в клеточки из раствора, в каком просто вымачивали червячков. Вводимая снаружи мРНК, кодирующая один из принципиальных белков C.elegans, слабо оказывала влияние на его синтез — очень мала была избранная экспериментаторами концентрация. Не действовала и зеркальная копия этой мРНК, так именуемая антисмысловая РНК, в какой все буквы-основания изменены дополнительными к ним. Такая антисмысловая РНК способна соединяться со собственной зеркальной парой подобно тому, как сцепляются нити ДНК. Ситуация резко поменялась, когда в той же концентрации червячкам вводили смесь смысловой и антисмысловой РНК. В растворе эти молекулы прилипали друг к другу, и образовавшаяся двухцепочечная РНК, невзирая на жалкую концентрацию (всего несколько молекул на клеточку!), практически стопроцентно подавляла синтез соответственного белка.
Спустя восемь лет Крейг Мелло пробудился посреди ночи поправить кровать собственной дочери и увидел, что телефон беззвучно мигает зеленоватой лампой — звонок был выключен. Часы демонстрировали 4.30. «Жена произнесла, что уже снимала трубку, — вспоминал позже Мелло, — и какие-то шутники разыграли ее, как будто я получил Нобелевскую премию. Но я все-же ответил». Это была не шуточка. Объявление шведского Каролинского института в 2006 году говорило: «Нобелевские лауреаты этого года открыли базовый механизм, который держит под контролем поток генетической информации».
Приманка для мясорубки
Проникнув в клеточку, двухцепочечная РНК попадает в жернова механизма, настроенного специально на ее обработку, о существовании которого 10 годов назад никто и не подозревал. Сперва на вторгшуюся молекулу набрасывается шинковальная машина, аккуратненько разрезающая ее на куски длиной в 21—23 основания. Эти куски получили заглавие малой ингибирующей РНК, либо siRNA. Данную аббревиатуру сейчас можно нередко повстречать в сообщениях о новых лекарствах для борьбы с вирусными болезнями и раком.
Белок, который шинкует РНК, получил заглавие Dicer, от британского слова dice — порезать кубиками. Открыли его преднамеренно, вычислив на компьютере структуру молекулы. Видя, что попавшая в клеточку длинноватая двухцепочечная РНК разрушается, ученые приблизительно представили, как должен смотреться фермент, приводящий к такому эффекту, потом отыскали участки генома, в каких он мог быть закодирован, и в конце концов синтезировали по ним белок.
Путь от ДНК к рибосоме полон угроз. Особенные RISC-комплексы охотятся сначала на РНК, несущие вирусный генетический код. Свою жертву RISС-комплекс определяет по маленьким кускам РНК — микроРНК (miR), оставшимся от прежних жертв. Но этих охотников можно нацелить и на глушение активности собственных генов клеточки, если специально «подбросить» им микроРНК с надлежащими кусками кода. Это открывает перспективу исцеления разных болезней, в том числе генетических. Фото: SPL/EAST NEWS
Нарезанные siRNA становятся наживой, на которую ловятся путешествующие в клеточке мРНК. С наживы снимается предохранитель — уходит одна из 2-ух цепочек siRNA. Оставшаяся одиночная цепь заряжается в непростой белковый капкан, именуемый RISC-комплексом. Матричная РНК, схожая на ту, которая разрезалась на недлинные siRNA, клюет на эту приманку, оказывается в мясорубке RISC, где и разрезается на маленькие куски. Для синтеза белка она после чего потеряна.
Этот механизм запускается с хоть какого шага — к примеру, возникновение в клеточке уже готовых, нарезанных siRNA провоцирует сборку RISC и ликвидирование матричных РНК, с участками которых совпадают siRNA. Клеточки растений, как выяснилось, могут передавать siRNA друг дружке по системе межклеточных каналов. Таким макаром, клеточки, которые никогда не встречались с чужеродным генетическим материалом, оказываются готовы к тому, чтоб этот материал уничтожать.
Некое время числилось, что сложным механизмом реакции на чужую РНК владеют только растения и примитивные животные вроде C.elegans, обделенные истинной иммунной системой. Но скоро шинковку Dicer и детали мясорубки RISC нашли у птиц, млекопитающих, животных и человека. Об актуальности этого антивирусного механизма свидетельствуют и сами вирусы, которые в процессе эволюционного противоборства «снаряда и брони» обзавелись своими приспособлениями для борьбы с siRNA. Посреди их, к примеру, особые белки, которые тормозят работу RISC-комплексов. Эти средства очень всераспространены у растительных вирусов, но их отыскали и у вирусов млекопитающих.
Открытие siRNA подарило новые надежды на лекарства от вирусных и онкологических болезней, а молекулярным биологам — заодно и надежды на новое финансирование. Кроме упоминавшегося продукта против ВИЧ, уже испытываются основанные на siRNA лекарства от рака поджелудочной железы и шеи матки, также от макулярной дистрофии — одной из основных обстоятельств утраты зрения в приклонном возрасте.
Прошлый президент Стэнфордского института Дональд Кеннеди, который до недавнешнего времени возглавлял журнальчик Science, считал, что перелом в генетике случился в 2007 году, когда «фокус исследовательских работ сместился с генетической последовательности к обоюдной регуляции генов». Не очень ли очень сказано для аппарата siRNA, который, кажется, нужен только для защиты от наружного генетического материала?
Генетический тормоз
В то самое время, когда ботаники-генетики по обе стороны океана удивлялись бледнеющим петуниям, Виктор Амброс с сотрудниками из Гарвардского института изучал суровые нарушения в развитии все тех же червячков C.elegans, вызванные мутацией в гене, обозначаемом lin-4. Для этого необходимо было отыскать белок, за который отвечал мутантный ген. Скрупулезно проходя ДНК участок за участком, Амброс с сотрудниками сделали открытие, которое отдало больше вопросов, чем ответов. Ген lin-4 оказался очень небольшим — всего 21 нуклеотидное основание — и вообщем не кодировал никакой белок.
Намек на разгадку отдала последовательность гена-коротышки. Она зеркально воспроизводила кусок гена, кодирующего белок LIN-14. Конкретно этот белок в аномально больших концентрациях выполнялся у мутантов с нарушениями в lin-4. Стало ясно, что верный ген lin-4 каким-то образом перекрывает лишний синтез данного белка. Так исследователи в первый раз наткнулись на доныне неведомый механизм регуляции активности генов. Но еще пару лет числилось, что отысканный механизм — экзотика, присущая только червякам.
Нематоды Caenorhabditis elegans — круглые червяки длиной около мм — один из обширно применяемых генетиками модельных организмов.
Перелом наступил исключительно в 2000 году, когда другая команда исследователей во главе с Гэри Равканом из Массачусетского лазарета в Бостоне отыскала таковой же маленький ген let-7. В отличие от lin-4 он перекрыл образование не 1-го, а сходу 5 белков. Скоро Равкан показал, что let-7 встречается у самых различных животных. А его близкий аналог нашелся в расшифрованном к тому времени людском геноме. Это уже нельзя было списать на экзотику круглых червяков, так как эволюция сохранила их фактически в постоянном состоянии у самых различных видов. Стало ясно, что открытый механизм играет важную роль для всего живого, позволяя регулировать активность генов при помощи собственных тормозящих РНК. Эти молекулы получили заглавие микроРНК, miRNA либо совершенно кратко — miR.
К исследованиям малых ингибирующих РНК подключилось огромное количество лабораторий по всему миру. Но любая из их докладывала о собственных результатах так, как будто смежных областей просто не существует. К примеру, исследователи miRNA некое время упрямо считали единственным предназначением siRNA защиту от вирусов, которая никак не связана с развитием организма. Исследователи siRNA, в свою очередь, считали, что miRNA — всего только личный случай механизма ликвидирования матричных РНК. Спецы до сего времени еще не условились по этим вопросам, но сейчас у miRNA и siRNA можно отыскать больше сходств, чем различий.
Эти два типа малых РНК очень близки по размеру (21—25 оснований). Смысл существования обоих — угнетение трансляции белка с матричной РНК. И miRNA и siRNA готовятся с помощью шинковки Dicer. Но если две половинки siRNA-основания плотно держатся совместно, пока эта маленькая РНК не попадет в капкан RISC, то miRNA путешествует по клеточке в виде одиночных цепочек. Путь обеих малых РНК завершается ролью наживы в комплексе RISC. При этом в случае siRNA эта нажива обычно прекрасно подходит к мРНК-мишени, а в случае miRNA может немного от нее отличаться.
Ранее числилось, что взаимодействие с siRNA ведет к незамедлительному уничтожению матричной РНК, а взаимодействие с miRNA просто перекрывает ее до того времени, пока она не разрушится в клеточке естественным методом. Сейчас все уже не так совершенно точно — обнаружены разрушающие и неразрушающие комплексы RISC, при этом и те и другие могут вести взаимодействие c обоими типами маленьких ДНК.
Пожалуй, самое принципиальное различие меж siRNA и miRNA — точность совпадения их последовательности с РНК-мишенью. У siRNA оно абсолютное, и потому действие этой молекулы очень избирательное — обычно, она перекрывает только одну последовательность матричной РНК, а означает, синтез 1-го белка. Напротив, miRNA не так отлично пристает к собственной мишени, но зато может связываться сходу с несколькими схожими РНК.
Есть и очередное несходство: за открытие siRNA Мелло и Файр уже стали нобелевскими лауреатами, а обнаруживший miRNA Амброс собственной премии пока так и не дождался.
Труднее, еще труднее
Обрисовывать жизнь обычный схемой «ДНК — РНК — белок» на данный момент вправду кажется доверчивым. В людском геноме уже найдено 695 микроРНК, и скоро это число, может быть, дойдет до 1000. Меж тем у человека всего около 20 000 генов, кодирующих белки. Если учитывать, что любая микроРНК оказывает влияние на работу нескольких из их, то выходит, что под контроль микроРНК попадает около трети людского генома. И это еще ограниченные оценки. Самые смелые экстраполяции отрисовывают картину, в какой число микроРНК превосходит число белковых генов. Все это складывается в неописуемо сложную систему регуляции, ведь малые РНК оказывают влияние не только лишь на матричные РНК, да и друг на друга. Клеточки вырабатывают их, чтоб биться с вирусами, а вирусы противодействуют этому, внося в клеточку свои антипоследовательности.
Этажи регуляции можно надстраивать друг над другом. К примеру, перекрыть miRNA при помощи siRNA, отпуская тем тормоз синтеза сходу огромного количества белков. И такие подходы уже употребляются в терапии. К примеру, заблокируя miR-122, которая встречается в главном в печени, можно вылечивать гепатит и регулировать синтез холестерина. Опыты на животных проявили, что таким методом удается понизить его уровень в крови на 40%.
Новые перспективы открываются и в деле исцеления рака. Некие виды рака крови, к примеру, сопровождаются завышенной выработкой ряда микроРНК. «Заблокировав» их, можно нарушить развитие раковых клеток. Другие виды рака, напротив, сопровождаются падением уровня неких микроРНК, которые как раз подавляют активность онкогенов.
Одним из кандидатов на роль противоракового средства возможно окажется уже ставшая «классикой жанра» микроРНК let-7. Введение ее мышам очень замедляло развитие у их рака легких. Но наибольшие надежды связываются не с самими микроРНК, эффект от введения которых стремительно проходит, а с их внедрением в купе с другими средствами терапии. Работа 1-го из первооткрывателей молекулы, Френка Слака, показывает, что введение let-7 делает опухоль чувствительной даже к малым дозам радиации. А другие микроРНК резко увеличивают эффективность химиотерапии.
Доставка курьером
Фуррор новых способов терапии при помощи малых РНК находится в зависимости от эффективности доставки этих молекул в нужные клеточки. Это непростая задачка: микроРНК хоть и именуются малыми, но все таки очень значительны, чтоб без помощи других просачиваться в клеточки человека. К тому же, циркулируя в кровотоке, эти нестойкие молекулы стремительно разрушаются.
На решении транспортной трудности сейчас сосредоточены большенные усилия ученых и фармакологических компаний. К примеру, группа под управлением Лифа Хуанга из Института Северной Каролины включает РНК в самособирающиеся микрочастицы из нескольких видов молекул. Один из этих видов «узнается» и интенсивно усваивается клеточками неких опухолей. Заодно клеточка поглощает и наночастицу, которая снутри распаковывается и высвобождает siRNA. В опухоли оказывается 70—80% всего введенного в организм продукта — выдающаяся точность доставки!
Другим методом пошла группа исследователей под управлением Премлаты Шанкар из Центра мед исследовательских работ Техасского технического института и Сан Кхюн Ли из корейского института Ханьян. Они создали конструкцию из siRNA и антител, «узнающих» сенсор на поверхности Т-лимфоцитов. Лифмоцит, на поверхность которого садилось такое антитело, проглатывал его совместно с прикрепленной siRNA, и та перекрыла работу генов ВИЧ, поразившего клеточку. Эта самая работа и описана в футуристическом духе сначала статьи. Беря во внимание продолжительность испытаний и регистрации, новые поколения препаратов от рака и СПИДа могут показаться лет через 7—10. И это неплохой повод, чтоб не жалеть о навечно утраченной простоте генетического кода.
Миша Попов
