|
Метод «искусственной эволюции» позволяет получать молекулы белков и РНК с заданными свойствами путем имитации естественных природных процессов: мутагенеза, размножения и естественного отбора. Метод чрезвычайно эффективен, но довольно трудоемок и дорог. Сначала нужно синтезировать исходную «библиотеку» разнообразных молекул, затем каким-то образом отобрать молекулы, обладающие нужным свойством хотя бы в минимальной степени. Отобранные молекулы размножают, внося в них небольшие случайные изменения (мутации), затем снова производится отбор — и так до тех пор, пока цель не будет достигнута. Большинство операций производится более или менее «вручную», причем для каждого этапа приходится подбирать условия, концентрации реагентов и др.
Естественно, специалисты заинтересованы в том, чтобы как-то автоматизировать этот процесс. Это позволило бы ускорить и удешевить получение нужных молекул, а заодно и сделать всю процедуру более похожей на то, что реально происходит в природе. Ведь живые организмы эволюционируют сами, без сознательного контроля извне.
Необходимым условием такой автоматизации является способность эволюционирующих молекул к размножению, то есть к производству своих собственных копий. Кроме того, если мы хотим, чтобы в «популяции» размножающихся молекул сам собой шел естественный отбор, необходимо добиться, чтобы скорость размножения этих молекул напрямую зависела от того свойства, которое мы хотим «развить» в ходе эксперимента. Те молекулы, у которых данное свойство выражено сильнее, должны оставлять больше потомков, то есть размножаться быстрее.
Эти условия легко соблюсти, когда речь идет о целых организмах, но очень непросто, когда дело касается отдельных молекул. Однако среди известных на сегодняшний день рибозимов (молекул РНК с каталитическими свойствами) есть несколько подходящих. Один из них и использовали молекулярные биологи из Скриппсовского исследовательского института (Scripps Research Institute, Ла-Холья, Калифорния) при разработке компьютеризированного устройства для автоматической «искусственной эволюции».
Рибозим, использованный исследователями, — РНК-лигаза класса I — был искусственно получен в 1993 году. Его каталитическая функция состоит в том, что он катализирует присоединение (лигирование) другой молекулы РНК к самому себе. Субстратом (присоединяемой молекулой) может служить далеко не всякая цепочка нуклеотидов: она должна содержать участок, комплементарный одному из участков рибозима. Комплементарные участки рибозима и субстрата соединяются водородными связями, образуя «уотсон-криковские» пары (см. последний рисунок). При этом свободный 3'-конец субстрата оказывается рядом с 5'-концом рибозима. Концы «сшиваются» — происходит лигирование.
В данной работе в качестве «субстрата» использовался олигонуклеотид смешанной природы: большая его часть построена из дезоксирибонуклеотидов, а последние четыре нуклеотида на 3'-конце являются рибонуклеотидами (UAUA). Таким образом, субстрат представляет собой очень короткую молекулу РНК, присоединенную к более длинной молекуле ДНК.
Главная хитрость состоит в том, что ДНК-овая часть субстрата содержит промотор, то есть участок, к которому может прикрепиться фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза. Этот фермент катализирует транскрипцию, то есть синтез РНК на матрице ДНК. Без промотора молекула ДНК не может быть транскрибирована.
Благодаря наличию промотора в молекуле субстрата рибозим РНК-лигаза приобретает требуемое свойство — способность размножаться, но только при условии успешного выполнения рибозимом своей каталитической функции.
Для того, чтобы рибозим начал размножаться, нужно добавить в среду два фермента: ДНК-зависимую РНК-полимеразу и обратную транскриптазу — фермент, осуществляющий синтез ДНК на матрице РНК (обратную транскрипцию). Вдвоем эти ферменты успешно осуществляют синтез копий рибозима, но только в том случае, если рибозим предварительно присоединил к себе субстрат с промотором. При размножении копируется не вся молекула (рибозим вместе с присоединенным субстратом), а только сам рибозим.
Таким образом, рибозимы с высокой каталитической активностью — те, которые быстро «находят», распознают и присоединяют к себе субстрат — будут размножаться быстро, а «медлительные» рибозимы с пониженной активностью будут размножаться медленно. Следовательно, будут сами собой отбираться, выигрывая конкуренцию за субстрат, самые эффективные рибозимы.
Компьютеризированная установка для искусственной эволюции, изготовленная учеными, устроена следующим образом. Ее главная рабочая часть представляет собой тонкую стеклянную трубочку, замкнутую в кольцо диаметром 1 см.
|
В этот кольцевой резервуар помещается исходный рибозим, который должен подвергнуться эволюционным преобразованиям. К кольцу присоединены дополнительные трубочки, по которым в систему подаются ферменты, субстрат и некоторые дополнительные вещества, в частности нуклеотиды, необходимые для синтеза РНК и ДНК. В кольце имеются клапаны, открытие и закрытие которых позволяет контролировать подачу веществ, перемешивание и обновление реакционной смеси. Работой клапанов управляет компьютер.
В кольцевом резервуаре рибозимы, сумевшие присоединить к себе молекулу субстрата, размножаются при помощи ферментов (фаза инкубации, см. рисунок, D). В раствор добавлен специальный флюоресцирующий краситель, присоединяющийся к молекулам рибозима. По силе флюоресценции можно следить за концентрацией рибозима. Как только эта концентрация увеличивается в 10 раз по сравнению с исходной, компьютер запускает программу «разбавления». 90% реакционной смеси удаляется из кольцевого резервуара (вместе с соответствующей частью молекул рибозима) и заменяется свежим раствором реагентов (субстрата и ферментов). Затем включается программа перемешивания (оставшиеся в резервуаре молекулы рибозима перемешиваются с новой порцией реагентов). Весь этот цикл повторяется раз за разом под управлением компьютера без всякого вмешательства человека.
За ходом эволюции можно следить по сокращению времени, затрачиваемого на прохождение системой одного цикла. Длительность цикла зависит от того, насколько быстро удесятерится концентрация рибозима, а это напрямую зависит от его (рибозима) эффективности. По мере того, как в ходе эволюции рибозимы становятся всё более эффективными, время прохождения циклов сокращается.
В ходе эволюции в кольцевом резервуаре точность копирования молекул рибозима весьма высока, мутации возникают редко. Поэтому для ускорения эволюции исследователи несколько раз прерывали автоматизированный процесс, извлекали реакционную смесь и подвергали молекулы рибозима интенсивному случайному мутированию. Это делалось при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием «неточных», склонных к ошибкам полимераз. Затем смесь рибозимов-мутантов возвращали в установку, и эволюция продолжалась под управлением компьютера. Исследователи использовали эти перерывы также для того, чтобы постепенно сокращать концентрацию субстрата в реакционной смеси — таким образом они «приучали» эволюционирующие молекулы обходиться всё меньшими количествами субстрата. Рибозимам приходилось приспосабливаться к жизни во всё менее «благоприятных» условиях.
После 70 часов искусственной эволюции, с пятью «перерывами на мутирование», каталитическая активность рибозима увеличилась в 90 раз. Для этого потребовалось всего 500 циклов инкубации и разбавления. Концентрация субстрата была снижена к концу эксперимента в 20 раз по сравнению с исходной.
Поскольку часть реакционной смеси изымалась из установки в конце каждого цикла, исследователи имели возможность в деталях проследить эволюцию подопытной популяции рибозимов. Выяснилось, что 90-кратный рост эффективности фермента произошел благодаря постепенному появлению и закреплению 11 мутаций. Авторы исследовали влияние каждой из этих мутаций по отдельности. Для этого они искусственно синтезировали варианты рибозимов с разными комбинациями мутаций. Оказалось, что 11 мутаций подразделяются на 4 функциональные группы, каждая из которых имеет свои особенности. Три из четырех групп повышают эффективность рибозима сами по себе, независимо от наличия или отсутствия других групп мутаций. Четвертая группа, как выяснилось, сама по себе не увеличивает, а в два раза уменьшает эффективность рибозима, однако в сочетании с другими мутациями она оказывает положительный эффект.
|
Самым мощным положительным действием, как выяснилось, обладают мутации, относящиеся к группе М3 (см. рисунок). Эти мутации расположены далеко от того участка молекулы рибозима, который служит для распознавания и связывания субстрата, однако они, похоже, каким-то образом помогают рибозиму находить субстрат. Об этом свидетельствует, в частности, следующий факт: в результате двух мутаций, относящихся к группе М3, образовалась последовательность нуклеотидов –GACCCAG–. Точно такая же последовательность благодаря мутации М2 сформировалась в «распознающем» участке рибозима, который образует «уотсон-криковские» связи с субстратом. Это, конечно, неспроста. Наука пока не в состоянии точно рассчитать, как именно этот (или другой) рибозим «ловит» свой субстрат и вступает с ним во взаимодействие. Но очевидно, что та «петля» рибозима, в которой располагаются мутации группы М3, как-то участвует в этом, иначе зачем бы в ней сформировался участок, комплементарный участку субстрата.
Авторы исследования оптимистично заключают, что в недалеком будущем, возможно, получить новый рибозим методом искусственной эволюции будет не труднее, чем запустить компьютерную программу. Их установка, считают они, вполне пригодна для эволюции не только рибозимов, но и целых микроорганизмов.
